Wprowadzenie kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej do analizy barwników roślinnych wiąże się z nazwiskiem Michaiła S. Cwieta1, choć już wcześniej były publikowane prace o stosowaniu tej techniki do rozdziału składników ropy naftowej. Podstawy techniki adsorpcyjnej chromatografii Cwiet przedstawił podczas wykładu dnia 21 marca 1903 roku w Sekcji Biologicznej Warszawskiego Towarzystwa Nauk Przyrodniczych

Cwiet miał wówczas 31 lat i był asystentem Uniwersytetu Warszawskiego.

Większość wiadomości o prywatnym życiu Cwieta i przebiegu studiów pochodzi z jego listów pisanych w latach 1896–1917 do przyjaciela w Szwajcarii, botanika Johna Isaaca Briqueta, znajdujących się w bibliotece Instytutu Botanicznego Uniwersytetu w Genewie. Ponadto nieliczne materiały dotyczące działalności Cwieta w Warszawie znajdują się w Archiwum Państwowym miasta stołecznego Warszawy w Sekcji „Uniwersytet Warszawski”. Akta Uniwersytetu Warszawskiego, wywiezione podczas ewakuacji Uniwersytetu do Rosji w 1915 roku przed wkroczeniem Niemców do Warszawy, po II wojnie światowej zostały Polsce przekazane przez Związek Radziecki; być może znajdą się dalsze materiały dotyczące tego okresu, który dla Cwieta był najbardziej naukowo płodnym i jak na ironię – jest nam najmniej znany. W 1940 roku J. Briquet opublikował krótką biografię Cwieta w pracy pt. Biographie des Botanistes à Genève. Później o Cwiecie pisali m.in. C. Dhéré, L. Zechmeister, T. Robinson, H. Strain i J. Sherma oraz K. Kosztojanc i K. Kalmykow.

Michaił Cwiet urodził się 14 maja 1872 roku w Asti (Piemont) we Włoszech, jako syn Szymona Cwieta, narodowości rosyjskiej, i Marii De Dorozza, obywatelki Italii. Jak wynika z notatek parafialnych w Asti, matka Michaiła miała wówczas 12 lat. W latach 1891–1896 Cwiet studiuje botanikę na Wydziale Przyrodniczym uniwersytetu w Genewie, a jego profesorami są botanicy Marc Thury i Robert Chodat, fizyk Charles Soret i chemik Philippe Auguste Guye. Szczególnie wysoko cenił sobie Cwiet naukę u prof. Chodata, którego nazywa swoim nauczycielem, a który rozbudził u niego zainteresowania w kierunku studiów nad fizjologią komórki roślinnej.

W 1896 roku Cwiet przenosi się do Petersburga, gdzie rozpoczyna pracę w laboratorium biologicznym oraz fizjologicznym Akademii Nauk u akademika Andreja Famincyna. Przystępuje do pracy nad chlorofilem. W 1899 roku publikuje pracę O nowych własnościach ciał białkowych, w której zwraca już uwagę na dwa zielone barwniki roślin, tak zwane chlorofiliny alfa i beta, i podaje sposób ich ekstrakcji z komórek. Poza badaniami w laboratoriach zajmuje się uczeniem panien z towarzystwa podstaw nauk przyrodniczych. Pracuje bardzo intensywnie i przygotowuje pracę magisterską, gdyż, jak wynika z jego korespondencji, dalsze swoje życie chce związać z karierą uniwersytecką w obrębie Imperium Carskiego. Ciekawe, że Cwiet nie broni pracy magisterskiej na Uniwersytecie Petersburskim, lecz na Uniwersytecie Kazańskim. Był to najsłynniejszy w ówczesnym okresie uniwersytet w Rosji, którego wychowankami byli między innymi twórca geometrii nieeuklidesowej Nikołaj Łobaczewski, Lew Tołstoj (nota bene skreślony z listy studentów „za brak uzdolnień”) oraz Włodzimierz Lenin. W 1901 roku Cwiet zdaje egzaminy magisterskie w Kazańskim Uniwersytecie i 21 września przedstawia swoją dysertację na stopień magistra botaniki pod tytułem Fizykochemiczna budowa ciałka chlorofilowego. Pracę tę wydaje w postaci niewielkiej książeczki, poświęcając ją pamięci swego ojca, „myśliciela i działacza”. Oponentami rozprawy magisterskiej Cwieta byli profesorowie: J. J. Gordiagin, W. I. Sorokin i N. W. Sorokin.

Od 1 stycznia 1902 roku Cwiet uzyskuje stanowisko starszego asystenta, tzw. nadetatowego laboranta, przy katedrze anatomii i fizjologii roślin Cesarskiego Uniwersytetu Warszawskiego. Nie znamy motywów, które skłoniły Cwieta do przyjazdu do Polski. Poziom Uniwersytetu nie był zbyt wysoki, choć wyszło z niego wielu świetnych profesorów, którzy pracowali później na uniwersytetach w odrodzonej Polsce (Odo Bujwid, Zdzisław Dmochowski, Wacław Sierpiński, Józef Nusbaum, Edmund Biernacki i inni), przyczyniając się w istotny sposób od odbudowy zniszczonych podczas I wojny światowej warsztatów pracy naukowej i dydaktycznej. Z różnych dokumentów z tego okresu dowiadujemy się, że do tzw. Priwislanskiego Kraju przybywali licznie pracownicy nauki z Rosji i studenci rosyjscy dla odbycia tutaj studiów. Warunki do pracy naukowej i do studiów były raczej dobre2.

Przybywający z Rosji pracownicy Uniwersytetu Warszawskiego otrzymywali specjalny dodatek do uposażenia, ale trudno przypuścić, aby u Cwieta ten czynnik grał istotną rolę przy podejmowaniu decyzji przybycia do Warszawy. Jako nadetatowy laborant był opłacany z kredytów pozabudżetowych i było to stanowisko wyższe niż asystenta i magistra. W każdym razie faktem jest, że w Warszawie magister botaniki Michaił Cwiet natychmiast rozpoczyna intensywną pracę naukową. Już 11 listopada 1902 roku na nadzwyczajnym posiedzeniu rady Wydziału Matematyczno-Fizycznego (był to najlepiej zorganizowany i obsadzony najlepszymi siłami fachowymi wydział Uniwersytetu) Cwiet wygłosił dwa próbne wykłady dla uzyskania tytułu prywatnego docenta3. Z protokołu posiedzenia wynika, że tytuł prywatnego docenta został mu wówczas nadany.

W 1907 roku Cwiet otrzymuje tytuł profesora botaniki i agronomii w Warszawskim Instytucie Weterynarii, a w rok później zostaje powołany na stanowisko profesora botaniki i mikrobiologii na Politechnice Warszawskiej, pracując równocześnie dalej na Uniwersytecie Warszawskim, gdzie pracę przerywa dopiero w 1909 roku. W 1908 roku Cwiet zwraca się z prośbą do Wydziału o zezwolenie na prowadzenie wykładów na pierwszym roku mikrobiologii ogólnej, podobnie jak to czynił w latach 1903–1904. Dziekan załączył prośbę Cwieta i skierował własne pismo do senatu w tej sprawie, ale, jak wynika z dokumentów Uniwersytetu, ministerstwo nie zezwoliło Cwietowi na prowadzenie wykładów. Z tego faktu można by wnosić, że Cwiet nie był w łaskach u ówczesnych czynników rządowych, a zwłaszcza kuratora Warszawskiego Okręgu Szkolnego, Aleksandra Apuchtina.

W 1910 roku, 28 listopada Cwiet przedstawił na Uniwersytecie Warszawskim monografię pt. Chlorofile w świecie roślin i zwierząt jako dysertację na stopień doktora botaniki. Oponentami pracy byli prof. botaniki Dmitrij Iwanowskij i Wikientij Chmielowskij oraz chemik prof. W. W. Kuryłow. Cwiet otrzymał wówczas drugi doktorat z botaniki (pierwszy uzyskał jeszcze jako pracownik Uniwersytetu w Genewie), a w 1911 roku – wielką nagrodę im. A. N. Achmatowa, nadaną mu przez Akademię Nauk za monografię o chlorofilu. Podczas inwazji armii niemieckiej na Warszawę w 1915 roku Cwiet wraz z całym Uniwersytetem został ewakuowany najpierw do Moskwy, a następnie do Niżnego Nowgorodu. W 1917 roku przebywał we Władykaukazie, gdzie leczył się jako chory prawdopodobnie na gruźlicę. Pod koniec tegoż roku został powołany na stanowisko profesora botaniki i dyrektora ogrodu botanicznego na Uniwersytecie w Dorpacie (Estonia). Inwazja Niemców na Estonię w 1918 roku ponownie spowodowała jego przeniesienie w głąb Rosji, tym razem do Woroneża, gdzie zmarł 26 czerwca 1919 roku, w wieku 47 lat.

W działalności naukowej Cwieta można rozróżnić trzy okresy:

1. okres genewski 1891–1896,
2. okres petersburski 1897–1901,
3. okres warszawski 1901–1915.

Ten trzeci, ostatni okres twórczości był okresem jego sukcesów i przyniósł mu światową sławę, choć dopiero w kilkadziesiąt lat po śmierci. Jeszcze jako student w Genewie, pracując w laboratorium prof. Thury, opracowuje zagadnienie teratologicznych zaburzeń u rośliny Lycium. W 1894 roku ogłasza drukiem pracę pt. Etudes de Physiologie Cellulaire, za którą otrzymał od Uniwersytetu Genewskiego nagrodę im. Humphry Davy’ego, a następnie doktorat z botaniki w 1896 roku. Już w tej pracy Cwiet wysuwa przypuszczenie, że chlorofil w roślinach jest związany z substancją białkową, nazywając to połączenie „chloroplastyną”. Wyodrębnia następnie ten białkowy kompleks z chlorofilem przez ekstrakcję rezorcynolem i wytrącenie wodą. Przez analogię do hemoglobiny nazywa go „chloroglobiną”, sugerując podobny mechanizm wiązania grupy prostetycznej, jak to ma miejsce w przypadku hemu i globiny. Podczas ekstrakcji zielonego barwnika z roztartych liści Cwiet używał węglanu wapnia do neutralizacji kwaśnych produktów roślin, które mogłyby powodować rozpad barwników. Zauważył wówczas, że oprócz karotenu wszystkie pozostałe barwniki adsorbowały się na węglanie wapnia. Osad przemywał dla oddzielenia zanieczyszczeń, a barwniki eluował mieszaniną eteru naftowego i alkoholu. Ta technika frakcjonowanej adsorbcji była przez Cwieta wielokrotnie stosowana w jego pracach i być może była natchnieniem do opracowania metody kolumnowej, na co zresztą wskazywałby ustęp z jego już wspomnianej pracy doktorskiej, o czym będzie mowa poniżej. W 1901 roku Cwiet stwierdza, że w zielonych liściach znajdują się dwa zielone barwniki, rozdzielając je od siebie za pomocą frakcjonowanej ekstrakcji, i nadaje im nazwy chlorofilina alfa i chlorofilina beta. Dla ścisłości należy dodać, że zarówno sposób rozdziału barwników, jak i myśl o złożonym charakterze barwnika zielonego pochodzi od Stokesa i Sorby’ego, którzy nie wykazali jednak tego w tak prosty i przekonywający sposób, jak to zrobił Cwiet. W następnych latach (1905–1906) wyosabnia z brunatnych alg inny barwnik, znany dziś jako chlorofil c (u Cwieta chlorofilina gamma), a którego obecność w materiale roślinnym w 36 lat później potwierdzili H. Strain i W. Manning. Z zabarwionych jesienią liści wyodrębnia barwniki powstające w wyniku obumierania roślin i stwierdza zanik chlorofilu, a pojawienie się związków z grupy antocyjanu, nazwanych przez niego „Herbstxantofil”. Stwierdza przy tym, że niektóre części rośliny ogrzewane z kwasami wykazują barwę czerwoną. Cwiet wyosobnił czerwony barwnik i określił jego własności fizykochemiczne, stwierdzając przynależność do grupy antocyjanu. Dziś znamy te barwniki roślinne, zmieniające barwę w obecności kwasów, jako leuko-antocyjany ponownie odkryte i zbadane przez O. Rosenheima w wiele lat po ich opisaniu przez Cwieta.

W 1897 roku D. T. Day, Amerykanin, publikując metodę rozdziału i oczyszczania składników ropy naftowej, stwierdza, że po przepuszczeniu oleju przez kolumnę wypełnioną sproszkowanym węglanem wapnia uzyskuje się znaczny stopień jego oczyszczenia. Na Międzynarodowym Kongresie Naftowców w Paryżu w 1900 roku Day przedstawił dalsze szczegóły przebiegu frakcjonowania węglowodorów na kolumnach z ziemią Fullera. Metoda Daya nie była jednak nazwana chromatografią. Odegrała ona istotną rolę w rozwoju metod analizy składników ropy naftowej, o czym świadczą liczne prace pojawiające się na ten temat w latach następnych. Między innymi C. Engler i E. Albrecht w 1900 roku zastosowali kolumnę do rozdziału różnych substancji, a zbierając frakcje spod kolumny, określali ich gęstość właściwą, lepkość lub temperaturę wrzenia. Powyższych autorów należałoby zatem uznać za prekursorów chromatografii kolumnowej, chociażby z uwagi na wcześniejsze daty ich publikacji. Ponadto, jak to wykazują H. Weil i T. Williams (1950), a również sam Cwiet w swojej monografii Chlorofile w świecie roślin i zwierząt, analiza kapilarna na bibule i w innych środowiskach była sporadycznie stosowana już od połowy XIX wieku, zwłaszcza do rozdziału barwników, i z dużym prawdopodobieństwem można przyjąć, że doświadczenia Cwieta nad chromatografią kolumnową swymi korzeniami sięgają do tych właśnie źródeł. Wydaje się jednak, że niezależnie od osiągnięć na polu chemii nafty, Cwiet nie znał tych prac, a w każdym razie na nich się nie wzorował.

W tym przekonaniu utwierdza nas również analiza prac Cwieta, a zwłaszcza te fragmenty różnych publikacji, które mają związek z omawianą techniką.

W 1906 roku ukazuje się pełna praca Cwieta w „Berichte der Deutschen Botanischen Gesellschaft”4, w której nazywa on swoją metodę chromatograficzną analizą adsorbcyjną lub krótko – chromatografią i podaje szczegóły tej techniki, opis aparatury oraz uzyskane wyniki podczas frakcjonowania mieszanin barwników wyekstrahowanych z zielonych części roślin.

Praca Cwieta opublikowana w „Berichte” może nawet dziś, po przeszło 50 latach, służyć jako wzór, jak powinny być konstruowane doświadczalne prace w zakresie analizy chemicznej i biochemii. Cwiet dobrze sobie zdawał sprawę z tego, że opisana przez niego metoda ma znaczenie uniwersalne i może być zastosowana do rozdziału mieszanin różnych substancji chemicznych.

Dalsze rozwinięcie techniki chromatografii kolumnowej podał Cwiet w swojej monografii Chlorofile w świecie roślin i zwierząt5 opublikowanej w Warszawie w 1910 roku.

Po opracowaniu swojej metody chromatografii kolumnowej Cwiet wykazał, że oprócz omówionych barwników w zielonych liściach znajduje się grupa barwników żółtych – ksantofili: ksantofil alfa’ i alfa”, zwany obecnie violaksantyną, ksantofil alfa, zwany luteinolem względnie właściwym ksantofilem, oraz ksantofil beta, zwany obecnie neoksantyną. Wszystkie te barwniki Cwiet doskonale rozdzielił na kolumnie i zidentyfikował na podstawie widm w spektroskopie przez siebie skonstruowanym.

Trzeba tu nadmienić, że mimo tych wyników Cwieta tak wytrawny badacz jak niemiecki chemik Richard Willstätter, który otrzymał ksantofil w stanie krystalicznym, nie uznał jego heterogenności i mocno krytykował Cwieta, a zmienił zdanie dopiero wtedy, gdy znacznie późniejsze badania przy zastosowaniu bardziej wyrafinowanych metod, na przykład adsorpcji na aktywnym tlenku magnezu, wykazały słuszność obserwacji Cwieta.

Szkoda, że tej opinii o pracach Cwieta Willstätter nie miał wówczas, kiedy ten je publikował i wykazywał niezbicie w sposób konsekwentny, że chlorofil można wydzielić, oczyścić i scharakteryzować za pomocą prostej techniki chromatograficznej, a nie tylko na zasadzie czysto chemicznych metod, badając pochodne chlorofilu w „wyniku reakcji z kwasami i zasadami”.

Tę samą zresztą zasadę wyłącznej reakcji z kwasami i zasadami przy ustalaniu struktury chlorofilu wyznawał nasz wielki chemik Leon Marchlewski. Marchlewski wykazywał w swoich pracach, że chlorofil traktowany kwasem daje dwa rodzaje pochodnych, tzw. filoksantynę i filocyjaninę. Sądził, że są to dwa różne stadia degradacji tej samej cząsteczki chlorofilu. Natomiast Cwiet wykazał logicznie, że jedna z tych pochodnych, którą otrzymywał Marchlewski, pochodzi z chlorofilu alfa, druga z chlorofilu beta (według jego nomenklatury tzw. chlorofilan alfa i chlorofilan beta). Kontrowersja ta spowodowała między obu uczonymi dramatyczną polemikę, dla nas dziś niezrozumiałą. Konflikt zaostrzał Willstätter, który ignorował zarówno prace Marchlewskiego, jak i Cwieta, tworząc własną nomenklaturę pochodnych chlorofilu i nie biorąc pod uwagę możliwości heterogenności zielonego barwnika roślin. Spór między uczonymi w początkach naszego wieku spowodował, że jedna z najbardziej przydatnych w nauce metod, jaką jest chromatografia, została zapomniana na okres prawie trzydziestu lat. Dopiero bowiem wówczas technika ta została ponownie wprowadzona do analizy chemicznej i jak widzimy, z wielkim powodzeniem.

W ciągu kilkunastu lat swego produktywnego życia Cwiet ogłosił 62 prace doświadczalne i rozprawy, w tym dwie książki. Z wyjątkiem jednej pozycji wszystkie prace były napisane przez niego samego. Należy z naciskiem podkreślić, że 38 pozycji bibliografii opracowane było w Warszawie i stąd wysyłane do druku w czasopismach francuskich, niemieckich i rosyjskich. Po wyjściu z Warszawy w 1915 roku Cwiet nie napisał już ani jednej pracy i ani jednego referatu. Okres warszawskiej twórczości Cwieta był dla niego najbardziej owocny i zapewnił mu na trwałe nazwisko w historii nauki światowej. Wszystko, co osiągnął w nauce, było dokonane w Polsce, na Uniwersytecie Warszawskim.